CRISPR) se yon teknik modifikasyon jenòm twazyèm jenerasyon: CRISPR te revolisyone mond lan

Repetisyon palindromik kout gwoupe regilyèman espasye (CRISPR) se yon teknik modifikasyon jenòm twazyèm jenerasyon ki revolisyone mond lan ak rezilta gwo débit li yo. Li te itilize pou trete divès maladi byolojik ak enfeksyon. Plizyè bakteri ak lòt prokaryot (tankou ake) genyen tou sistèm CRISPR/Cas9 pou defann kont faj yo. Yo rapòte ke estrateji ki baze sou CRISPR/Cas9 ka anpeche kwasans ak pwogresyon kansè nan tete trip negatif (TNBC) lè yo vize jèn rezistans ki potansyèlman modifye, transkripsyon, ak règleman epigenetik. Entèvansyon terapetik sa yo ka ede adrese pwoblèm difisil tankou rezistans dwòg yo obsève menm nan TNBC. Kounye a, yo itilize divès metòd pou delivre CRISPR/Cas9 nan selil sib yo, tankou fizik (mikwoenjeksyon, elektwoporasyon ak mòd idrodinamik), viral (viris adeno-asosye ak lentivirus) ak non-viral (lipozòm ak nanopartikil lipid). )-patikil). Malgre ke plizyè modèl te devlope pou etidye kòz molekilè TNBC yo, mank metòd sansib ak siblé pou bay zouti modifikasyon jenòm in vivo limite aplikasyon klinik yo. An rezime, revizyon sa a egzamine an pwofondè pwogrè, defi, limit ak pèspektiv tretman CRISPR/Cas9 pou TNBC ki baze sou prèv ki deja egziste yo. Nou mete aksan tou sou kijan konbinezon entèlijans atifisyèl ak aprantisaj otomatik ka amelyore estrateji CRISPR/Cas9 nan tretman TNBC a.
Kansè karakterize pa divizyon selilè san kontwòl, dezòd nan pwen kontwòl sik selilè, ak mitasyon nan jèn siprimeur timè (TSG) (Matthews et al., 2022). Pami diferan kalite kansè yo, kansè nan tete se kalite kansè ki pi komen nan fanm epi li gen yon gwo to mòtalite atravè lemond (Waks ak Winer, 2019). Kansè nan tete se yon maladi etewojèn ak divès karakteristik, tankou karakteristik istolojik ak byolojik, prezantasyon klinik ak konpòtman, ak repons a tretman (Weigelt et al., 2010). Klasifikasyon kansè nan tete bay enfòmasyon presi pou dyagnostik kansè nan tete ak pronostik timè. Itilizasyon byomarkè komen ak karakteristik klinikopatolojik te kritè prensipal pou klasifikasyon kansè nan tete (Tsang ak Tse, 2019). Pronostik ak repons a tretman kansè nan tete enfliyanse pa plizyè faktè, tankou prezans reseptè estwojèn (ER), reseptè pwojestewòn (PR), reseptè faktè kwasans epidèm imen 2 (HER2/neu), ak klas istolojik, kalite timè, ak klas. gwosè ak metastaz ganglyon lenfatik (Al-Tubaiti, 2020). Yo idantifye senk soutip molekilè intrinsèk kansè nan tete, tankou luminal A, luminal B, rich an HER2, bazal-like, ak claudin-low (Prat et al., 2015). TNBC se yon soutip molekilè kansè ki pa eksprime tout ER, PR, ak HER2 (Yin et al., 2020). Karakteristik patolojik sa yo asosye avèk TNBC, sa ki konfime pwogresyon rapid li ak nati pi agresif li pase nenpòt lòt kalite kansè nan tete (Feng et al., 2018). Anplis de sa, Peru et al (2000) te itilize teknoloji microarray pou reklasifye kansè nan tete epi idantifye senk soutip intrinsèk kansè nan tete (Cadenas, 2012). Kansè nan tete bazal-like se yon soutip kansè nan tete ki gen yon fenotip trip negatif epi ki asosye avèk pwogresyon rapid. Li enpòtan pou note ke tout kansè nan tete ki sanble ak kansè bazal yo souvan mal dyagnostike kòm TNBC, men se sèlman 77% ki TNBC; Okontrè, 71-91% nan TNBC yo ki sanble ak kansè bazal, sa ki endike ke de kalite kansè nan tete sa yo sipèpoze epi reprezante diferan klasifikasyon (Wang D.-Y. et al., 2019). Sa kreye yon nesesite pou karakterize eterogeneite TNBC a pou klarifye pronostik la epi idantifye repons potansyèl yo a tretman aktyèl ak nan lavni. Anplis de sa, TNBC reprezante 15-20% nan tout ka kansè nan tete epi li pi komen nan fanm ki poko gen 50 an. Yo rapòte mitasyon BRCA1 oswa BRCA2 nan apeprè 20% nan ka TNBC yo (Xie et al., 2017; Tzikas et al., 2017). , 2020). Etid yo montre tou ke TNBC gen yon mikwoanviwònman iminitè distenk ki gen ladan gwo nivo faktè kwasans andotelyal vaskilè, makrofaj ki asosye ak timè (TAM), lenfosit ki enfiltre timè (TIL), ak lòt molekil ki enplike nan kwasans ak migrasyon timè. Se poutèt sa, konprann mikwoanviwònman TNBC a enpòtan anpil pou pronostik ak tretman li (Fan ak He, 2022).
Pou evalye pronostik TNBC a epi asire yon tretman efikas, li enpòtan pou fè yon dyagnostik egzat, sitou baze sou imunoistochimi (IHC) pou detekte ER, PR ak HER2, epi mamografi pou detekte neoplasm nan tete. Sepandan, mamografi pa ka byen dekri karakteristik intratumoral tankou nekwoz ak fibwoz (Deepak Singh et al., 2021). Piske move pronostik ak dyagnostik anpeche doktè yo preskri bon medikaman yo (Chaudhary, 2020), yo itilize plizyè estrateji pou amelyore swen pou pasyan ki gen TNBC. Kounye a, yo itilize de medikaman, doxorubicin ak siklofosfamid, nan pasyan ki gen TNBC epi yo montre bon rezilta. Anplis de sa, yo itilize lòt medikaman platinum, tankou karboplatin ak cisplatin (Sikov et al., 2015). Anplis de sa, yo te itilize inibitè PARP tankou Olaparib, Velaparib, ak PF-01367338 kòm potansyèl medikaman chimyoterapi pou tretman TNBC (Ishino et al., 2018). Piske yo rapòte ke chemen siyalizasyon Wnt/b-Catenin, NOTCH, ak Hedgehog enplike nan aparisyon ak pwogresyon TNBC, vize dwòg nan chemen sa yo kapab yon estrateji enpòtan (Aysola et al., 2013). Malgre ke chiriji, radyoterapi ak chimyoterapi rete prensipal tretman pou TNBC jodi a, pwogrè siyifikatif te fèt nan devlopman nouvo tretman tankou terapi siblé, iminoterapi, divès zouti koreksyon jèn ki gen rapò ak CRISPR tankou Cas9n, dCas9, CRISPR/Cas12, koreksyon prim, ak terapi jèn ki vize CRISPR/Cas9. La a nou pral konsantre sou divès zouti koreksyon jèn ki gen rapò ak CRISPR yo itilize nan tretman TNBC. Pami yo, CRISPR/Cas9 te resevwa yon atansyon laj.
Cas9n, ke yo rele tou Cas9 nikaz, se yon varyant pwoteyin Cas9 ki te modifye jenetikman e ki sòti nan sistèm modifikasyon jenòm CRISPR/Cas9 la (Gupta et al., 2019). Nan fòm orijinal li, pwoteyin Cas9 la gen de domèn nikleaz: RuvC ak HNH, fonksyon prensipal yo se klivaj tou de seksyon ADN yo. Sepandan, nan Cas9n, youn nan domèn nikleaz yo, HNH, sibi mitasyon jenetik epi li vin inaktif. Se poutèt sa, domèn HNH Cas9n nan rete san fonksyon. Se sèlman domèn RuvC ki rete aktif, sa ki pèmèt Cas9n koupe oswa kreye repo sou seksyon ADN endividyèl (Trevino ak Zhang, 2014). Konpare ak Cas9, Cas9n ka efektivman diminye efè ki pa sou sib la epi amelyore mekanis reparasyon selilè yo avèk presizyon. Yo ka itilize Cas9n pou rezoud divès pwoblèm, tankou kreye repo nan kote espesifik nan ADN doub-chèn. Pou rezon sa a, yo te konbine de molekil Cas9n epi yo te itilize yo ansanm (Yee, 2016). Kinaz liyaj melanje 3 (MLK3) se yon kinaz pwoteyin aktive pa mitojèn ki sèvi kòm yon regilatè kle pandan metastaz TNBC (Cronan et al., 2012).
MLK3 ka aktive plizyè chemen siyalizasyon ki mennen nan metastaz TNBC. Pa egzanp, chemen c-Jun N-terminal kinaz (JNK) la kontwole mobilite selilè ak degradasyon matris ekstraselilè, epi MLK3 aktive chemen JNK a, kidonk amelyore mobilite selilè epi konfere pwopriyete envaziv (Rattanasinchai ak Gallo, 2016). MLK3 kontwole EMT tou. Pou fè sa, li aktive faktè transkripsyon an aval tankou Snail, Slug ak Twist. Faktè sa yo anpeche ekspresyon makè epitelyal yo epi ankouraje ekspresyon makè mezenchimal yo, sa ki mennen nan akizisyon yon fenotip metastatik (Casalino et al., 2023). Yo obsève MLK3 jwe yon wòl nan remodelasyon ECM ak aktivasyon pwoteyaz tankou metaloproteinaz matris (MMP) ki degrade ECM a. Sa fasilite envazyon selil timè yo ak pwopagasyon nan sit ki lwen (Katari et al., 2019). Kidonk, etid anvan yo te montre ke MLK3 jwe yon wòl kritik nan TNBC. Rattanasinchai ak Gallo te itilize modèl TNBC pou etidye wòl MLK3 epi yo te jwenn ke li ankouraje devlopman kansè atravè chemen siyal espesifik. Yo te itilize CRISPR/Cas9n pou modifye MLK3 epi yo te obsève yon rediksyon siyifikatif nan metastaz TNBC (Rattanasinchai ak Gallo, 2016).
dCas9, souvan rele Cas9 inaktif, se yon fòm derive modifye nan pwoteyin Cas9 la. Kontrèman ak Cas9 aktif la, dCas9 pa gen aktivite andonikleaz, sa ki fè li pa kapab pwovoke kraze doub-chèn ADN. Se poutèt sa, yo ka itilize dCas9 pou vize avèk presizyon rejyon espesifik nan jenòm lan san okenn chanjman oswa modifikasyon nan sekans ADN lan (Wang et al., 2016). Nan dCas9, de pwoteyin andonikleaz, RuvC ak HNH, yo inaktive lè yo siprime rezidi asid amine enpòtan. (Richter et al., 2016). Malgre mank aktivite klivaj ADN li, dCas9 jwe yon kantite wòl enpòtan nan rechèch jenetik ak byoteknoloji. Pa egzanp, li pèmèt vizyalizasyon rejyon espesifik nan jenòm lan, fasilite règleman transkripsyonèl, epi li ankouraje modifikasyon epigenetik (Brocken et al., 2018).
Faktè transkripsyon ZEB1 la (zinc finger E-box binding homeobox 1) jwe yon wòl espesifik ak kritik nan medyasyon tranzisyon epitelyal-mezenkimal (EMT), yon pwosesis selilè ki rive pandan devlopman anbriyonik, reparasyon tisi, ak pwogresyon kansè. Li enplike transfòmasyon selil epitelyal yo an selil mezenkimal, sa ki lakòz chanjman nan mòfoloji selilè, mobilite, envazivite, elatriye (Wu et al., 2020). ZEB1 inibi plizyè makè epitelyal, tankou E-cadherin ak Occludin, ki responsab pou kenbe adezyon selil-selil ak polarite selil epitelyal nan TNBC (Moreno-Bueno et al., 2008). Anplis de sa, ZEB1 aktive sèten makè tankou N-cadherin, vimentin ak fibronectin (Konradi et al., 2014) epi li kontwole tou jèn ki enplike nan remodelasyon sitoskelèt tankou Rho GTPaz ak metaloproteinaz matris (MMP) (Huang et al., 2014). 2022), anplis de sa, li afekte tou divès chemen siyalizasyon tankou faktè kwasans transfòmasyon-β (TGF-β), siyalizasyon Wnt, elatriye, kidonk li ankouraje envazyon timè ak metastaz nan TNBC (Chen et al., 2016). Anpil etid ak prèv syantifik endike ke ZEB1 gen gwo potansyèl kòm yon ajan enpòtan pou deteksyon ak entèvansyon terapetik TNBC. Nan yon etid resan, Waryah et al. te itilize yon modèl TNBC epi yo te reyalize yon sipresyon konplè ZEB1 pa dCas9. Kidonk, yo te obsève yon espesifikite trè wo ak yon inibisyon prèske konplè ZEB1 nan kondisyon in vivo (Waryah et al., 2023).
CRISPR/Cas12 se yon zouti pou modifye jèn yo rele CRISPR/Cpf1. Li sòti nan sistèm CRISPR/Cas la, kote tèm Cas12 la refere a pwoteyin 12 ki asosye ak CRISPR (Bharathkumar et al., 2022), ki konplètman menm jan ak Cas9. Sèl diferans lan se ke li gen pwoteyin Cas12 la. Konpare ak Cas9, Cas12 gen kèk fonksyon inik tankou jenere bout kolan pandan pwosesis modifikasyon jèn nan, tandiske Cas9 jenere bout mou (Wang et al., 2021). Pwopriyete Cas12 sa a kontribye nan teknoloji manipilasyon ADN espesifik li. Kòm yon pwoteyin ki kapab rekonèt ak koupe ADN sib avèk presizyon, li gen yon adaptabilite ekstraòdinè, sa ki fè li yon zouti efikas pou yon varyete aplikasyon, tankou modifikasyon jèn (Pickar-Oliver ak Gersbach, 2019).
Menm jan ak lòt varyant CRISPR yo, CRISPR/Cas12 kapab tou elimine oswa aktive jèn nan TNBC, vize jèn ki jwe yon wòl enpòtan nan patogenez li oswa repons a tretman (Yang ak Zhang, 2023). Pou reyalize pwosesis sa a, yo te devlope yon ARN gid (gRNA) ki dirije Cas12 nan direksyon jèn sib la. Yon fwa Cas12 mare ak sib li a, li entwodui doub-brin rupture nan ADN epi li aktive mekanis reparasyon ADN. Pandan pwosesis reparasyon an, yo ka enkòpore nukleotid ki pa kòrèk, sa ki mennen nan mitasyon jèn ak pèt fonksyon (Zhang et al., 2021a). Anplis de sa, yo te itilize tou yon vèsyon amelyore nan anzim Cas12 la (yo rele dCas12) pou aktive jèn yo. Lè yo konbine li avèk yon aktivatè transkripsyon, li posib pou pwovoke sèten jèn, kidonk aktive yo. Teknoloji sa a gen yon gwo potansyèl nan pwomosyon aktivasyon jèn siprime timè (Sultan et al., 2022).
Modifikasyon prim lan se yon teknoloji modifikasyon jenòm ki fèk devlope e ki siperyè anpil. Li kapab modifye ADN yon òganis avèk anpil presizyon (Chen ak Liu, 2023). Modifikasyon prim lan reyalize atravè entegrasyon de eleman prensipal: yon anzim CRISPR/Cas9 modifye ak yon transkriptaz envès. Wòl anzim CRISPR/Cas9 la se vize sit presi nan jenòm lan avèk anpil presizyon, alòske transkriptaz envès la ede modifye ADN nan nèt nan kote sib la (Hassan et al., 2021). Nan mekanis modifikasyon amorseur a, premye etap la enplike kreyasyon yon ARN gid modifikasyon amorseur (pegRNA) (Standage-Beier et al., 2021). Li genyen sekans sib la ak modèl ARN ki koresponn ak sit modifikasyon ki vle a nan ADN sib la. Apre sa, yo entwodui pegRNA a nan selil sib yo ansanm ak yon nikleaz modifikasyon amorseur (PE2). PE2 se yon pwoteyin fizyon ki gen ladan yon anzim Cas9, yon transkriptaz envès, ak yon adaptè modifikasyon amorseur (Martín-Alonso et al., 2021). Anndan selil la, konplèks pegRNA ak PE2 yo ap chèche ADN espesifik yo vle modifye a. Anzim Cas9 la koupe ADN nan epi li kreye yon modèl ki gen ladan l yon sèl fil (Choi et al., 2022). Transkripsyon envès la itilize modèl sa a pou prepare ADN nan pou modifikasyon. Ansanm ak kopye ADN nan, enstriksyon pou modifye modèl ARN nan enkli tou. Finalman, fil ADN ki fèk kreye a itilize kòm yon modèl pou repare fann ADN nan, sa ki lakòz yon sekans ADN modifye ki gen modifikasyon yo vle a (Ochoa-Sanchez et al., 2021). Mekanis modifikasyon primer yo ka mennen nan mitasyon toupatou nan jèn yo. Li ka vize mitasyon ponktyèl, ensèsyon, sipresyon, e menm ranplasman jèn (Anzalone et al., 2019; Chen ak Liu, 2023). Modifikasyon primer ofri plizyè avantaj parapò ak teknoloji modifikasyon jenòm anvan yo. Sa yo enkli plis presizyon, mwens efè ki pa nan sib la, ak kapasite pou modifye ADN san ou pa bezwen konte sou fann doub fil ADN (Anzalone et al., 2020).
Teknoloji CRISPR/Cas9 la te devlope okòmansman pou pwoteje bakteri kont transfè plasmid ak enfeksyon faj epi pita li te reitilize kòm yon zouti siblaj ADN ki baze sou ARN pou modifikasyon jenòm (Jiang ak Doudna, 2017). Anplis de sa, yo rapòte ke sistèm CRISPR/Cas9 la prezan nan 50% ak 87% nan jenòm bakteri ak akeyal, respektivman (Ishino et al., 2018). CRISPR/Cas9 se yon zouti potansyèl pou sipresyon, ensèsyon ak koreksyon nenpòt sekans jenetik anormal lè l sèvi avèk mòd in vivo ak in vitro (Sabit et al., 2021). Anplis, yo montre ke CRISPR/Cas9 fè pati sistèm iminitè adaptatif la akòz espesifikite li pou jèn sib ki enterese yo (Chen ak Zhang, 2018).
CRISPR/Cas9 konsiste de Cas9 ak yon sèl ARN gid (sgARN). Cas9 se yon andonikleaz ki konpoze de plizyè konpozan pwoteyin. Anplis de sa, Cas9 gen pwopriyete estriktirèl ak konfòmasyonèl inik (Pacesa et al., 2022) paske li konsiste de de lòb: rekonesans (REC) ak nikleaz (NUC). Lòb REC a divize an twa rejyon tou: REC1, REC2, ak elis pon (Cromwell et al., 2018). NUC a konsiste de twa lòb, sètadi RuvC (RuvC I, RuvC II, RuvC III), HNH ak domèn entèraksyon motif adjasan protospacer (PAM) (Fig. 1) (Song et al., 2016). sgARN konsiste de de konpozan, ki gen ladan ARN CRISPR (crARN) ak ti ARN transkodan (ARN trasè) (Figi 1). ARN sig la konekte pwoteyin Cas9 la ak koneksin yo pou fòme yon konplèks aktif, ke yo rele tou konplèks efektè a (Richter et al., 2012). ARN sig la se yon pè baz 18-20 nikleotid ki jwe yon wòl enpòtan nan rekonèt sekans ADN sib yo. Anplis de sa, ARN sig la pè ak ADN sib la, epi ARN sig la aji kòm yon echafodaj pou nikleaz Cas9 la mare ADN sib la (Manghwar et al., 2019). Yon lòt bò, sekans PAM lan gen 3 nikleotid, ki konfime, presize epi medyatè lyezon konplèks efektè a ak ADN nan. Sou-inite konplèks pwoteyin Cas9 yo, RuvC ak HNH, gen aktivite katalitik (Richter et al., 2012; Asmamaw ak Zawdie, 2021). Domèn nikleaz HNH sou-inite Cas9 la fann seksyon ADN ki asosye ak ARN sig la. Domèn nikleaz RuvC a fann lòt fil ADN yo epi li jenere doub-fil kase (DSB), apre sa de mekanis reparasyon diferan pou kase ADN yo aktive (Jiang ak Doudna, 2017) (Figi 1).
Figi 1. Apèsi sou CRISPR/Cas9 (A). Konpozan sistèm CRISPR/Cas9 la: (i). Andonkleaz Cas9 la responsab pou koupe sekans ADN sib la, (ii) yon sèl ARN gid (sg) ki soti nan fizyon ARNcr ak chimè tra-ARNcr. (de). Cas9 gen ladan plizyè konpozan tankou Rec I, Rec II, lòb NUC (HNH ak Ruv C se sou-konpozan) ak domèn entèraksyon PAM (C) ak fonksyon korespondan yo. Konplèks pwoteyin CRISPR/Cas9 la divize sekans ADN yo an fòm ki pa konplemantè ak konplemantè (D). CRISPR/Cas9 modifye jenòm lan an twa etap: rekonesans, koupe ak reparasyon. ARN-sg ki fèt la gide Cas9 epi rekonèt sekans ki vle a atravè konpozan konplemantè ARNcr la. Cas9 rekonèt sekans PAM nan 5′-NGG-3′ epi fonn ADN nan, fòme yon ibrid ADN-ARN epi aktive klivaj la. Domèn HNH Cas9 la fann seksyon konplemantè a, epi domèn RuvC la fann seksyon ki pa konplemantè a. CRISPR/Cas9 repare ADN doub-brin lè li kase li nan de fason: jwenti bout ki pa omolog (NHEJ) ak reparasyon ki dirije pa omoloji (HDR). NHEJ repare ADN doub-brin nan absans ADN omolog etranje atravè yon pwosesis anzimatik, yon mekanis ki gen tandans fè erè epi ki ka mete oswa retire sekans ADN o aza. HDR trè espesifik epi li mande modèl ADN omolog.
Chemen reparasyon medyatè CRISPR/Cas9 yo enkli mekanis reparasyon ki pa omolog nan bout (NHEJ) ak reparasyon ki dirije pa omoloji (HDR). NHEJ se yon chemen ki gen tandans fè erè paske li enplike ensèsyon oswa sipresyon epi li pa mande okenn modèl pandan mekanis reparasyon an. Li itilize nikleotid o aza pou jenere pwoteyin estanda (Abbasi et al., 2021). Sistèm reparasyon sa a konsiste de kat konplèks tankou konplèks KU a, konplèks pwoteyin ki konplete kwaze tip 4 (XRCC-4), anzim pwosesis bout ADN nan, ak pwoteyin kinaz ADN-PKcs la (Abbasi et al., 2021). Pwoteyin konplèks KU a gen de sou-inite, Ku 70 ak Ku 80, epi li jwe yon wòl enpòtan nan mekanis NHEJ la, piske mekanis reparasyon an inisye pa lyezon de sou-inite (Ku 70 ak Ku 80) ak bout mou oswa prèske mou ADN sib la (Abbasi et al., 2021), ki sèvi kòm yon echafodaj pou rekrite lòt faktè ki gen rapò ak NHEJ nan sit blesi a (Yang et al., 2020). XRCC-4 ak ligaz ADN yo konpoze de 334 ak 911 asid amine, respektivman, epi konplèks XRCC4-ligaz ADN IV la estimile ligasyon bout ADN yo (Chatterjee et al., 2015). Anzim pwosesis bout ADN, ke yo rele tou polinikleotid kinaz 3'-fosfat, se yon anzim pwosesis bout ADN. Li ka retire gwoup 3'P nan ADN epi fosforile gwoup 5'OH la pandan reparasyon DSB. Li enplike tou reparasyon kase yon sèl fil (SSB) lè l sèvi avèk chemen reparasyon SSB a (Chatterjee et al., 2015). Pwoteyin kinaz DNA-PKcs se yon pwoteyin kinaz depandan sou ADN ki konsiste de yon sou-inite katalitik nan PIKK yo (kinaz ki gen rapò ak fosfatidilinozitol 3-kinaz) ak fanmi ataksya telanjyèktazi ki sibi mitasyon (ATM), ansanm ak ATR ki gen rapò ak ATM ak Rad3. Kase fil (DSB) ak kase yon sèl fil (Yue et al., 2020; Peng et al., 2016).
HDR se yon mekanis reparasyon ki pi egzak e ki pi apwopriye paske enfòmasyon an kopye lè l sèvi avèk fòm entak duplex ADN omolog la, byenke li mande prezans kromatid sè yo. Sa rive pandan faz S/G2 sik selilè mamifè a. HDR rive sitou nan espès ledven, men NHEJ enpòtan anpil nan mamifè yo (Burma et al., 2006; Abbasi et al., 2021). Mekanis reparasyon konplè a montre nan Figi 1.
Piske TNBC a koze pa anomali jenetik ak epigenetik, koreksyon anomali jenomik/epigenetik malfezan yo lè l sèvi avèk CRISPR/Cas9 kapab yon apwòch terapetik rezonab (Chen et al., 2019). Anplis de sa, kèk faktè transkripsyon ki enplike nan règleman transkripsyon espesifik selil yo kapab montre karakteristik inik nan selil kansè yo, sa ki sijere ke règleman transkripsyon an kapab yon ekselan apwòch pou tretman kansè (Drost et al., 2017). Eksplwate karakteristik molekilè sa yo nan timè yo, tankou domaj jenetik, epigenetik ak transkripsyon, pou devlopman dwòg ka amelyore rezilta klinik yo epi redwi depans depistaj yo. CRISPR se yon zouti potansyèl pou modifye jèn ki pa sèlman ka detekte ak idantifye sib jenomik ki lakòz kansè, men ki kapab tou itilize pou modifye, siprime, ak modifye epigenetikman onkojèn nan selil imen (Tablo 1) (Ahmed et al., 2021). Plizyè tès depistaj CRISPR yo te fèt pou chèche jèn ki asosye avèk siprimeur timè, onkojèn, ak rezistans dwòg. Itilizasyon CRISPR/Cas9 pou modifye divès onkojèn TNBC yo montre nan Figi 2.
Figi 2. Modifikasyon jèn plizyè onkojèn TNBC lè l sèvi avèk CRISPR/Cas9 ki lakòz yon rediksyon nan kwasans timè ak metastaz. Onkojèn sa yo enkli CDK7, NAT1, UBR5, YTHDF2, ITGA9, CXCR4 ak CXCR7, Crypto1, ROR1 ak ST8SIA, ki enplike nan aparisyon ak metastaz TNBC.
Migrasyon selil kansè, envazyon, ak tranzisyon epitelyal-mezenkimal (EMT) yo asosye avèk ITGA9. Etid anvan yo te montre ke ITGA9 se yon jwè kle nan chemen Notch la epi li jwe yon wòl enteresan nan metastaz rabdomyosarkòm (Molist et al., 2020). Anplis de sa, yo te jwenn ke ITGA9 te asosye avèk pronostik pasyan nan plizyè kalite timè, tankou kansè nan tete (Wang Z. et al., 2019). Anplis de sa, analiz byoenformatik ITGA9 te montre ke ekspresyon li nan TNBC te siyifikativman pi wo pase nan lòt soutip kansè nan tete. Nivo ITGA9 ki wo yo asosye avèk metastaz timè ak rechit nan pasyan TNBC. Anilasyon ITGA9 pa CRISPR/Cas9 te lakòz pwopriyete ki sanble ak selil souch kansè (CSC), anjyojenèz timè, kwasans timè, ak metastaz redwi lè li pwomouvwa degradasyon β-catenin nan TNBC (Wang Z. et al., 2019).
Crypto-1 se yon manm nan fanmi TGF-β epi li enpòtan pou anbriyojènèz bonè, antretyen selil souch, ak metastaz kansè (Ishii et al., 2021). Li konnen tou kòm Tdgf-1, li se yon pwoteyin siyalizasyon onkojenik ki ankre nan GPI ki enplike nan règleman fòmasyon liy primitif la, mezodèm ak andodèm, osi byen ke etablisman asimetri gòch/dwat nan devlopman ògàn kò yo pandan anbriyojènèz (Zhang et al., 2021b). Anplis de sa, yo te montre ke Cripto-1 enplike nan tranzisyon epitelyal-mezenkimal (EMT) kòm yon makè selil souch (Zhang et al., 2021b). EMT enpòtan non sèlman pou divès pwosesis tankou devlopman anbriyonè, fibwoz ak gerizon blesi, men tou pou envazyon kansè ak metastaz. Anplis de sa, yo te montre ke Cripto-1 kominike avèk kat reseptè Notch epi amelyore matirasyon pòs-tradiksyonèl yo (Brandstadter ak Maillard, 2019). Yo konnen chemen siyalizasyon Notch la enplike nan antretyen selil kansè nan tete imen yo. Etid yo montre ke lè CRISPR/Cas9 bloke Crypto-1, sa siprime kwasans kansè a ak metastaz li. Se poutèt sa, Crypto-1 ka vin tounen yon sib terapetik enpòtan pou TNBC (Castro et al., 2015).
Pwoteyin XCL12 ak reseptè chemokine li a CXC (CXCR4 ak CXCR7) jwe plizyè wòl nan pwoliferasyon, kwasans, migrasyon ak envazyon selil kansè yo (Wu et al., 2015). Chimoreseptè sa yo te asosye avèk devlopman TNBC atravè plizyè chemen siyalizasyon nan modèl in vivo ak in vitro (Wu et al., 2015). Anplis de sa, aktivasyon CXCR4 ak CXCR7 asosye avèk yon pi gwo sansiblite pou metastaz ak yon move pronostik nan TNBC (Karn et al., 2022). Se poutèt sa, sipresyon CXCR4 ak CXCR7 ka vin jèn sib efikas pou tretman kansè nan tete, tankou TNBC. Yon etid pa Yang et al. Yang et al (2019) te itilize CRISPR/Cas9 pou ko-siprime jèn CXCR4 ak CXCR7 yo epi yo te jwenn ke pwoliferasyon, kwasans, migrasyon ak envazyon TNBC yo te siyifikativman inibite (Yang et al., 2019).
Yo te obsève yon ogmantasyon nan nivo miR-3662, yon onkojèn TNBC, nan tisi kansè nan tete (Yi et al., 2022). Yo te montre ke rediksyon miR-3662 la anpeche kwasans timè kansè nan tete ak metastaz ni in vivo ni in vitro (Agarwal ak Gupta, 2021). HBP-1 se yon inibitè puisan nan siyalizasyon Wnt/-catenin epi li pwobableman responsab pou kwasans selil TNBC ki medyatè pa miR-3662. Dènyèman, Yi et al. te jwenn ke aks miR-3662-HBP1 la kontwole chemen siyalizasyon Wnt/-catenin nan selil TNBC yo (Yi et al., 2022). Akòz ekspresyon espesifik timè li, miR-3662 ka yon sib terapetik potansyèl pou TNBC. Kidonk, rediksyon miR-3662 ki medyatè pa CRISPR/Cas9 ka yon ekselan apwòch pou devlope nouvo dwòg pou tretman TNBC.
UBR5 se yon nikleofosfoprotein 300 kDa ke yo te idantifye kòm yon regilatè kle nan timorigenèz, metastaz, ak repons iminitè nan divès kansè (Shearer et al., 2015; Fu et al., 2023). Yo rapòte ke UBR5 trè ogmante nan echantiyon TNBC epi li estimile fonksyon ERα lè li pwovoke pwoliferasyon atravè aktivite ubiquitin ligase li (Bolt et al., 2015). Etid sekansaj ègzòm konplè nan echantiyon TNBC prensipal yo te montre tou yon ogmantasyon nan ekspresyon UBR5, ki sijere wòl li nan devlopman TNBC. Anplis de sa, sipresyon UBR5 ki te koze pa CRISPR/Cas9 te montre yon inibisyon siyifikatif nan metastaz ak kwasans TNBC nan modèl sourit eksperimantal. Anplis, enklizyon UBR5 nan yon modèl sourit tip sovaj te retabli tout fonksyonalite li, alòske efè sa a pa te obsève nan souch mutant inaktive (Liao et al., 2017). Mank UBR5 asosye avèk ogmantasyon apoptoz, nekwoz, ak anpèchman kwasans timè nan TNBC akòz anjyojenèz ki pòv. Akòz pèt UBR5, pwopagasyon timè a nan ògàn ki lwen yo redwi, epi UBR5 pwovoke EMT anòmal sitou lè li diminye ekspresyon E-kaderin (Zhang ak Weinberg, 2018). Dènyèman, yo te montre ke UBR5 se yon faktè trè enpòtan nan transkripsyon PDL1 pwovoke pa IFN-γ nan TNBC akòz mank aktivite ubikitinasyon E3 li. Analiz transkriptòm ARN te revele ke UBR5 ka gen efè sistemik sou jèn ki asosye avèk chemen IFN-γ la epi ankouraje transaktivasyon PDL1 lè li ogmante nivo aktivasyon ARN pwoteyin kinaz (PKR) ak transdiktè siyal ak aktivatè li yo. transkripsyon 1 (STAT1) ak faktè regilatè entèferon 1 (IRF1). Sepandan, ablasyon konbine ekspresyon UBR5 ak PD-L1 medyatè pa CRISPR/Cas9 gen yon efè terapetik sinèjik pase nenpòt blokaj poukont li, ak efè pwofon sou mikwoanviwònman timè a (Wu et al., 2022). Kidonk, CRISPR/Cas9 ka yon zouti enpòtan pou anpeche fonksyon UBR5, kidonk siprime metastaz TNBC ak kwasans timè.
ROR1 se yon pwoteyin transmembran tip I ki eksprime pandan kansè ak devlopman anbriyonè epi yo idantifye li kòm yon pwoteyin onkofetal (Nicholas Borcherding, 2014). Konpòtman envazif divès kansè imen yo asosye avèk ogmantasyon ROR1. Rezilta pwomètè yo te jwenn nan etid in vivo ak in vitro ki enplike konpoze terapetik ki vize ROR1 (Chien et al., 2016). Nivo ki wo nan ARNm ROR1 nan byopsi tisi tete yo te asosye tou avèk timè tete agresif ki sanble ak bazal (BL) ak migrasyon yo nan lòt pati nan kò a. Anplis de sa, yo idantifye surekspresyon ROR1 kòm yon makè pronostik pou devlopman TNBC (Chien et al., 2016). Sepandan, silansye ROR1 lè l sèvi avèk CRISPR/Cas9 pou siprime kwasans ak metastaz TNBC ta yon estrateji efikas.
Pwosesis sialilasyon an enplike adisyon asid sialik nan glikokonjige yo, ki katalize pa sialiltransferaz (ST). ST8SIA1 fè pati fanmi ST epi li jwe yon wòl enpòtan nan patogenez divès maladi tankou lesemi lenfositik ak kansè kolorektal (Chang et al., 2018). Analiz sekans ARN montre ke ST8SIA1 trè eksprime nan tisi tete pasyan ki gen TNBC epi li korele pozitivman ak mitasyon nan jèn siprimeur timè p53 la, ki ka kontribye nan patogenez TNBC (Battula et al., 2017). Anplis de sa, ST8SIA1 enplike nan metastaz ak repetition TNBC, sa ki sijere ke li jwe yon wòl enpòtan nan aparisyon ak devlopman TNBC. Nan yon modèl in vitro TNBC, yo te montre ke rediksyon ST8SIA1 pa CRIPSR/Cas9 bloke kwasans ak metastaz (Battula et al., 2017). Sa sijere ke CRISPR/Cas9 ka yon zouti enpòtan pou inibi fonksyon onkojèn ST8SIA1 la nan tretman TNBC.
NAT1 se yon anzim metabolik ki katalize fòmasyon konpoze ksenobyotik faz II epi li eksprime nan prèske tout tisi imen. NAT1 ka itilize kofaktè folat pou vize asetil-CoA (asetil-CoA) menm nan absans substrat amin aromatik la (Stepp et al., 2015; Laurieri et al., 2014). Etid yo montre ke NAT1 kontwole fonksyon matris metaloproteinaz 9 (MMP9) nan modèl selil kansè nan tete epi li pwoteje kont espès oksijèn reyaktif (ROS) pandan grangou glikoz (Wang et al., 2018). Yo montre ke sipresyon NAT1 anpeche konplèks dezidrogenaz piruvat la, sa ki mennen nan disfonksyon mitokondriyal (Wang L. et al., 2019). Anplis de sa, plizyè lòt rapò montre ke inibisyon NAT1 lè l sèvi avèk ti molekil ak silansman siRNA ka diminye envazivite ak pwopagasyon selil kansè nan tete (Stepp et al., 2018). Resaman, yo te itilize CRISPR/Cas9 pou siprime NAT1 nan liy selil kansè nan tete MDA-MB-231, sa ki afekte metabolis selilè a selon nivo ekspresyon li. Etid sa a te montre tou ke NAT-1 enpòtan pou pwogresyon ak metastaz TNBC (Carlisle et al., 2020).
Transkripsyon kowòdone onkojèn yo reglemante pa super amelyoratè, faktè transkripsyon ak kofaktè (Hnisz et al., 2015). Anplis de sa, yon gwoup kinaz depandan de siklin (CDK), tankou CDK7, CDK8, CDK9, CDK12, ak CDK13, nesesè pou regilasyon transkripsyon. Pami yo, CDK7 enplike nan fosforilasyon ARN polimeraz II, ki trè enpòtan pou inisyasyon ak ekspansyon transkripsyon onkojèn nan patogenez TNBC. Nan yon etid orijinal, sipresyon CDK7 pa CRISPR/Cas9 te inibi TNBC, sa ki endike ke patogenez TNBC depann de CDK7 (Wang Y. et al., 2015).
Etid yo montre ke mitasyon nan MYC ak RBP (pwoteyin ki mare ARN) ka mennen nan apoptoz, alòske mitasyon jèn endividyèl nan MYC oswa RBP pa afekte kwasans selil kansè yo (Einstein et al., 2021). Yo te teste plis pase 1000 RBP nan jenòm imen an lè l sèvi avèk yon bibliyotèk ki baze sou CRISPR/Cas9. Pami yo, yo te jwenn 57 RBP ki kritik pou kwasans selil kansè ki gen nivo MYC ki wo anpil (Wheeler et al., 2020). Anplis de sa, YTHDF2 enpòtan pou kenbe kwasans selil TNBC epi li diminye kantite transkripsyon metile pandan transkripsyon ak tradiksyon wo nivo nan selil kansè ki gen pi gwo ekspresyon MYC. Anplis de sa, YTHDF2 pa esansyèl pou selil kansè yo, ki mwens depann sou nivo MYC ki wo pou pwolonje siviv pasyan TNBC yo (Einstein et al., 2021), sa ki sijere ke li ka yon sib terapetik potansyèl pou dwòg ki ka simonte TNBC.
Pwoteyin dwèt zenk (ZNF) yo reprezante apeprè 1% nan total jenòm imen an. Etid yo montre ke ZNF ka kontwole pwopagasyon selil nan divès kansè, tankou kansè nan fwa, kansè nan tete ak kansè kolorektal (Zhang W. et al., 2021; Li et al., 2017). Bibliyotèk ki pwodui pa CRISPR knockout yo te itilize pou tès depistaj divès jèn siprime timè (TSG) nan selil kansè nan tete (Shalem et al., 2014). Depi lè sa a, yon etid transkriptomik sou selil kansè nan tete CRISPR/Cas9 ki gen ZNF319 efase te montre ke ZNF319 se yon jèn siprime timè ki diminye pwopagasyon kansè nan tete e pakonsekan li enplike nan divès mekanis siyalizasyon potansyèl ak lòt fonksyon byolojik (Wang L. et al., 2022).
Feroptoz se yon kalite lanmò selilè pwograme ki depann de prezans fè. Li konnen ke devlopman feroptoz enfliyanse pa prezans peroksid lipid. Anplis de sa, yo rapòte ke PKCβII montre peroksidasyon lipid bonè, epi ogmantasyon peroksidasyon lipid asosye avèk feroptoz. Tès depistaj yon bibliyotèk inibitè kinaz medyatè CRISPR/Cas9 te revele ke PKCβII enplike nan pwosesis peroksidasyon lipid la, ki enpòtan pou feroptoz nan selil MDA-MB-231 (Zhang et al., 2022). Se poutèt sa, sa sijere ke eliminasyon PKCβII pa CRISPR/Cas9 ka yon sib potansyèl pou jèn siprime timè pou tretman maladi ki gen rapò ak feroptoz (Zhang et al., 2022).
Yo kwè rezistans dwòg responsab pou apeprè 90% nan lanmò nan pasyan kansè epi li se youn nan gwo defi nan tretman kansè (Bukowski et al., 2020). Rezilta yo endike ke yon kantite sifizan jèn ki gen rapò ak efli dwòg, reparasyon ADN, apoptoz ak divès chemen siyal selilè asosye avèk rezistans dwòg (Haider et al., 2020). Pami yo, plizyè jèn te vize pa zouti CRISPR/Cas9 epi yo te montre rezilta pwomèt nan rediksyon rezistans dwòg ak ogmante efikasite tretman anti-kanser yo (Vaghari-Tabari et al., 2022). Anplis de sa, bibliyotèk tès depistaj jèn CRISPR/Cas9 wo-debi yo te enplike nan modifye fonksyon potansyèl sib jèn rezistans dwòg (Shalem et al., 2015). Pou idantifye jèn rezistans paklitaksèl, yo te itilize sekans ARN makonnen ak tès depistaj bibliyotèk sgARN nan tout jenòm lan pou idantifye uit jèn kandida, tankou histone deasetylase 9 (HDAC9), ki asosye avèk rezistans dwòg nan pasyan ki gen TNBC rekiran (B et al., 2020). Nan yon lòt etid, yo te obsève yon ogmantasyon nan ekspresyon diserine/treonine ak tyrosine protein kinase (DSTYK) pandan siviv pasyan TNBC trete ak dwòg antikanser. Anplis de sa, rediksyon DSTYK medyatè pa CRISPR/Cas9 te ogmante anpil apoptoz selil kansè rezistan dwòg in vitro (selil SUM102PT ak selil MDA-MB-468) ak yon modèl TNBC in vivo (Ogbu et al., 2021).
Malgre ke TNBC gen yon aktivasyon anòmal nan chemen MAPK a, efè klinik terapi ki vize MEK yo pa bon. Yon tès depistaj bibliyotèk jenomik CRISPR/Cas9 te revele ke inibisyon PSMG2 (chaperon asanblaj pwoteyòm 2) sansibilize selil TNBC BT549 ak MB468 yo anvè inibitè MEK AZD6244 la. Rediksyon PSMG2 pa CRISPR/Cas9 te modifye fonksyon nòmal pwoteazòm nan, sa ki te mennen nan dezasanblaj PDPK1 ki te medyatè pa otofaji, kidonk amelyore selil timè yo plis toujou nan modèl sourit TNBC ki pwovoke pa AZD6244 (inibitè MEK) ak MG132 (inibitè pwoteazòm). Kidonk, yo ka administre inibitè pwoteazòm ak MAP kinaz (MEK) ansanm pou diminye pwopagasyon selil timè (Wang X. et al., 2022).
Yo te itilize CRISPR/Cas9 tou pou tcheke pèt fonksyon jèn ki mennen nan rezistans TNBC (Shu et al., 2020). Ge et al te eksplike mekanis rezistans selil kansè trete ak JQ1, yon inibitè bromodomèn BET (BBDI), nan TNBC. Lè yo te itilize CRISPR/Cas9, yo te jwenn ke sipresyon jèn rb1 la te lakòz TNBC vin rezistan a medikaman anti-kansè JQ1 la. Se poutèt sa, fonksyon rb1 enpòtan nan repons a medikaman JQ1 nan TNBC. Yo te rapòte tou ke paklitaksèl se yon inibitè kinaz/mikrotubil CDK4/6, epi konbinezon li ak BBDI tankou JQ1 ka bay repons terapetik pwomèt pou TNBC rezistan a medikaman (Ge et al., 2020).
Yo rapòte ke peyizaj transkripsyonèl ARN long ki pa kodan (lncRNA) responsab rezistans a terapi neoadjuvan nan TNBC. Etid sa a montre ke senk diferan transkripsyon MALAT1 lncRNA yo trè eksprime nan TNBC. Anplis de sa, sipresyon MALAT1 medyatè pa CRISPR/Cas9 ogmante sansiblite selil TNBC BT-549 yo a paklitaksèl ak doksorubisin, sa ki sijere yon wòl potansyèl pou rezistans MALAT1 nan TNBC (Shaath et al., 2021).
Mitasyon nan BRCA1 (BRCA1m) yo etewojèn e pakonsekan difisil pou detekte. Vize PARP1 (poli(ADP-riboz) polimeraz), patnè letal sentetik BRCA1 la, ka ogmante kemosensibilite dwòg TNBC. Lè yo itilize CRISPR/Cas9, sipresyon PARP1 ogmante sansiblite dwòg antikanser tankou doxorubicin, gemcitabine ak docetaxel pou selil TNBC mutant mBRCA1, sa ki sijere ke PARP1 enplike tou nan rezistans dwòg nan TNBC (Vaghari-Tabari et al., 2022). Mitasyon nan jèn siprimeur timè BRCA1 oswa BRCA2 yo li te ye pou ogmante chans pou devlope kansè nan tete lakay moun. Tretman pasyan sa yo mande pou itilizasyon inibitè PARP. Anplis de sa, li te demontre ke lè yo retire faktè sovtaj nikleotid DNPH1 la lè l sèvi avèk CRISPR/Cas9, sa ka retire monofosfat nikleotid toksik 5-idroksimetildeoksiuridin (hmdU) la, kidonk amelyore repons selil ki defisyan BRCA yo a sansiblite a inibitè PARP yo (Fugger et al., 2021). Kidonk, inibitè CRISPR/Cas9 ak PARP1 yo ka vin yon estrateji tretman enpòtan pou TNBC.
Jèn glikoprotein penetran (P-gp) la se yon jèn rezistans milti-dwòg ki jeneralman ogmante nan apeprè 41% nan tout TNBC (Sun et al., 2020). Yo idantifye efli dwòg pwovoke pa P-gp kòm yon regilatè kle nan rezistans dwòg nan kansè nan tete. Inibitè P-gp yo te demontre yon ogmantasyon nan sansiblite a dwòg antikanser nan kansè nan tete (Famta et al., 2021). Kidonk, ablasyon oswa sipresyon P-gp ak inibitè P-gp medyatè pa CRISPR/Cas9 ka metòd trè enpòtan pou simonte rezistans dwòg nan TNBC.
Transpòtè kasèt ki mare ATP G2 (ABCG2) li te ye pou lakòz rezistans dwòg nan TNBC (Palasuberniam et al., 2015), byenke kounye a pa gen okenn rapò sou relasyon ki genyen ant silansman CRISPR/Cas9 ak ABCG2 ak inaktivasyon jèn siprimeur timè. PTEN ka amelyore aktivasyon ABCG2 (Palasuberniam et al., 2015), (Deepak Singh et al., 2021). Se poutèt sa, itilizasyon CRISP/Ca9 pou retire ABCG2 epi konbine li avèk yon inibitè ABCG2 ka yon tretman apwopriye pou simonte rezistans dwòg nan TNBC. Tablo 2 mansyone CRISPR/Cas9 ki vize tout jèn rezistans yo.
Tablo 2. CRISPR/Cas9 vize plizyè jèn rezistans TNBC pou sansibilize selil yo a medikaman antikanserèz.
Bibliyotèk CRISPR/Cas9 yo se zouti potansyèl pou tès depistaj mitasyon jèn ki asosye avèk patogenez kansè (Chan et al., 2022). Metòd tès depistaj sa a enplike kat etap tankou (a) konstriksyon bibliyotèk, (b) transdiksyon lentiviral, (c) tès depistaj fenotipik, ak (d) analiz jèn sib. Malgre ke TNBC gen yon aktivasyon anòmal nan chemen MAPK a, pronostik klinik terapi sible MEK pou pasyan TNBC ki pote mitasyon nan jèn siprimeur timè tankou PTEN, RB1, ak TP53 trè pòv.
Anplis de sa, yon tès depistaj jèn pou inaktivasyon jèn lè l sèvi avèk CRISPR/Cas9 te teste molekil ki pi puisan e selektif la, deidrokatrol, ki abondan nan ekstrè flè ak fèy Gwatemalyen yo, pou konprann efè deidrokatrol sou MDA-MB-231. Mekanis sitotoksisite selilè selektif. Karakteristik tij mezenkimal soutip TNBC yo. Tès depistaj CRISPR/Cas9 sa a te revele tou ke HSD17B11, yon jèn ki kode 17β-idroksisteroid deidrojenaz tip 11, trè eksprime nan selil MDA-MB-231 yo e sa lakòz deidrofalkarinol espesifik pou selil MDA-MB-231 yo (Grant et. al., 2020). Kidonk, sa sijere ke tès depistaj jenomik CRISPR/Cas9 gen yon gwo potansyèl nan idantifye mekanis ki kache dèyè pwopriyete antikanserèz konpoze natirèl potansyèl yo.
Anplis de sa, yo te etidye vilnerabilite TNBC a kansè lè l sèvi avèk yon tès depistaj in vivo CRISPR/Cas9 san patipri sou tout jenòm lan, ki te montre yon lyen ant chemen onkojenik ak siprimeur timè. Yo rapòte ke konpozan kle nan chemen mTOR ak Hippo yo jwe wòl enpòtan nan regilasyon timè nan TNBC. Anplis de sa, etid yo montre ke inibisyon famakolojik onkoprotein mTORC1/2 ak YAP anpeche patojènite TNBC efektivman lè l sèvi avèk yon modèl sinèji dwòg-matris in vitro ak ksenogrèf in vivo ki sòti nan pasyan yo. Anplis, inibisyon mTORC1/2 medyatè pa Torin-1 amelyore makropinositoz, alòske inibisyon YAP pwovoke pa verteporfin mennen nan lanmò selil TNBC. Lè yo mete tout ansanm, rezilta sa yo mete aksan sou puisans ak robustès tès depistaj CRISPR in vivo sou tout jenòm lan pou idantifye tretman nouvo ak efikas pou TNBC (Dai et al., 2021).
Disreglasyon sistèm iminitè a se yon faktè enpòtan nan timèjènèz. Selil kansè yo evite eliminasyon iminitè a lè yo kontoune mekanis defans yo, tankou entèfere ak aktivite selil iminitè yo nan mikwoanviwònman timè a epi konpwomèt sistèm iminitè a. Se poutèt sa, devlope yon sistèm iminitè amelyore kapab yon apwòch kle pou konbat timè yo. Itilizasyon modifikasyon jèn ki baze sou CRISPR/Cas9 adrese plizyè pwoblèm ki gen rapò ak disfonksyon iminitè nan diferan pèspektiv. CRISPR/Cas9 te itilize pou amelyore iminite antitimoral kont kansè nan tete atravè chemen sa yo (Figi 3).
Figi 3. Iminoterapi CRISPR/Cas9 vize selil TNBC yo. Pèt CDK5 ak rediksyon PDL1 ak CD155 amelyore sistèm iminitè a. Menm jan an tou, pèt A2AR ak rediksyon TAA tankou HER2, mucin 1 ak TEM8 ogmante efikasite selil CAR-T yo nan touye selil kansè yo. Tès depistaj selil T ki baze sou CRISPR/Cas9 montre ke dezòd kinaz p38 amelyore aktivite antitimoral selil T yo. Selil T modifye pa CRISPR/Cas9 ogmante ekspresyon TCR (reseptè selil T), sa ki lakòz selil T yo gen aktivite antitimoral.
Objektif iminoterapi a se pou ankouraje sistèm iminitè a pou l atake selil kansè yo. Twòp ekspresyon pwoteyin pwen kontwòl iminitè yo anjeneral anpeche reyaksyon otoiminitè men li ka ede kansè yo evite yo (Topalian et al., 2015). Pwoteyin sa yo anpeche reyaksyon iminitè yo lè yo mare ak reseptè sou sifas selil iminitè yo. Plizyè pwoteyin pwen kontwòl (tankou CD155 ak PD-L1) vize reseptè PD-1 sou selil iminitè yo epi yo eksprime nan kansè nan tete, espesyalman TNBC (Li Y.-C. et al., 2020). Rediksyon PD-L1 oswa reseptè li a lè l sèvi avèk CRISPR/Cas9 ka ankouraje sistèm iminitè a pou atake timè TNBC yo (Yahata et al., 2019). Anplis de sa, yo te montre ke diminisyon ekspresyon PD-L1 atravè sipresyon CDK5 medyatè pa CRISPR/Cas9 anpeche kwasans timè in vitro ak in vivo (Deng et al., 2020). Anpèchman kwasans nan modèl kansè nan tete in vitro ak in vivo sijere ke rediksyon CD155 ki medyatè pa shRNA ka gen yon efè terapetik sou kansè nan tete (Gao et al., 2018).
Selil CAR T yo eksprime CAR ki rekonèt antijèn ki asosye ak timè (TAA) epi ki ka itilize rediksyon pwoteyin pwen kontwòl pou amelyore aktivite yo (Li C. et al., 2020). Gen plizyè sib potansyèl pou terapi selil CAR T nan kansè nan tete, tankou plizyè TAA tankou HER2, mucin1, ak TEM8 (Bajgain et al., 2018). Gen prèv ki montre selil CAR T ki vize mezotelin (ki twò eksprime nan selil TNBC BT-459) pi efikas kont kansè lè yo retire PD-1 lè l sèvi avèk CRISPR/Cas9 (Hu et al., 2019). Sepandan, izole selil T nan pasyan yo epi modifye yo ex vivo se yon pwosesis ki mande anpil travay epi ki pran anpil tan. Malgre ke selil T inivèsèl yo ka diminye kondisyon izolasyon yo, selil T donatè ki eksprime antijèn lekosit imen (HLA) klas I ak reseptè selil T (TCR) yo ta dwe retire pou anpeche anomali grèf-kont-lame (Ren et al., 2017). , 2017a). Lè l sèvi avèk CRISPR/Cas9, HDR ka elimine TCR ak HLA an menm tan epi elimine jèn ki kode CAR la. Etid yo montre ke CRISPR/Cas9 ka itilize pou entwodui CAR anti-CD19 nan locus TCR a, kidonk pwodui CAR avèk efikasite san yo pa diminye selil T yo (Dimitri et al., 2022). Teknoloji miltiplèks yo te devlope pou jenere selil T CAR alojenik lè yo elimine TCR, beta-2-mikroglobulin (B2M), souinite HLA-I ak lòt pwoteyin tankou PD-1 ak CTLA-4 an menm tan, ki ka gen pi gwo pwopriyete antikanser kont TNBC (Eyquem et al., 2017; Liu et al., 2017; Ren et al., 2017b; Dimitri et al., 2022).
Itilizasyon CRISPR/Cas9 te kapab amelyore efikasite selil CAR-T yo. Li konnen ke adenosin gen pwopriyete imunosupresè epi li ka diminye iminite antikanserèz lè li bloke fonksyon selil T yo epi aktive reseptè adenozin A2A (A2AR) (Vigano et al., 2019). Silansman A2AR lè l sèvi avèk CRISPR/Cas9 te amelyore efikasite selil CAR-T yo in vivo anpil (Giuffrida et al., 2021). Li konnen ke selil T yo montre divès karakteristik fenotipik tankou ekspansyon selilè, diferansyasyon, estrès oksidatif ak estrès jenomik. Tès depistaj selil T ki baze sou CRISPR/Cas9 te revele dezòd nan 25 diferan kinaz reseptè selil T. Pami yo, yo te montre ke sipresyon kinaz p38 amelyore aktivite antitimoral selil T yo, sa ki endike ke kinaz p38 se yon regilatè kle nan règleman selil CAR-T (Gurusamy et al., 2020).
Yo ka modifye selil T yo jenetikman lè l sèvi avèk CRISPR/Cas9 pou pwodui TCR ki byen eksprime. Transfere selil T jenetikman modifye bay pasyan yo te montre yon aktivite antikanser ki pi fò pase selil T andojèn yo. Se poutèt sa, TCR andojèn yo ka fè konpetisyon ak TCR jenetikman modifye nan pasyan yo, sa ki ka gen enpak sou potansyèl iminoterapi kansè a. Pou simonte pwoblèm sa a, lè l sèvi avèk CRISPR/Cas9 pou retire TCR-β andojèn nan selil reseptè yo epi answit transfere selil TCR-β bay pasyan kansè yo, sa ka montre pi bon repons iminitè antikanser san yo pa bezwen konpetisyon seksyèl TCR andojèn (Fan et al. 2018). Kidonk, eksepte selil T modifye ak CRISPR, TCR yo mil fwa pi sansib a antijèn timè pase selil T nòmal ki transdi ak TCR. Anplis de sa, nan divès lesemi, selil T modifye ki pwodui pa γδ TCR+ CRISPR montre yon ekspresyon ki pi wo nan selil T CD4+ ak CD8+ pase transfè TCR estanda (Legut et al., 2018). Kidonk, selil T modifye ki pwodui pa CRISPR/Cas9 yo ka yon metòd iminoterapi efikas pou simonte TNBC.
Entegrin yo se molekil adezyon selilè ki prezan nan transmembran selilè yo epi ki ankouraje lyezon selil yo ak matris ekstraselilè a (ECM) (Hamidi ak Ivaska, 2018). Disregilasyon integrin yo asosye avèk devlopman ak migrasyon kansè lè yo modifye matris ekstraselilè a, sa ki mennen nan siviv selil kansè yo nan sikilasyon an (Hamidi ak Ivaska, 2018). Rediksyon integrin medyatè CRISPR/Cas9 ralanti pwogresyon timè, metastaz, ak kolonizasyon nan TNBC. Yo rapòte ke rediksyon integrin a5 (ITGA5) diminye migrasyon ak pwogresyon selilè nan lòt kansè tankou kansè nan poumon (Ju et al., 2017), sa ki sijere ke integrin a5 kapab tou yon faktè kle nan patogenez TNBC.
Jenere sourit knockout lè l sèvi avèk metòd tradisyonèl selil souch anbriyonik (ES) se yon pwosesis ki mande anpil travay, ki pran anpil tan, epi ki pa efikas. Li pran plizyè mwa ak plizyè ane pou vize selil ES yo atravè rekombinasyon omolog, kwaze sourit kimerik, epi answit kwaze yo ak sourit etewozigòt pou pwodui pitit omozigòt. Kwaze konplèks nesesè pou kreye sourit ki gen plizyè mitasyon jenetik. Sepandan, anpil pwoblèm te leve lè w ap itilize sourit ki pwodui pa ablasyon selil ES lè l sèvi avèk CRISPR/Cas9 oswa pa mikwo-enjekte konpozan CRISPR/Cas9 nan ze fètilize yon sèl selil. Pa egzanp, entwodiksyon chanjman yo souvan rive nan lokus byalelik epi li pa espesifik pou yon jèn. Yo te rapòte dènyèman ke selil ES lè l sèvi avèk teknoloji CRISPR/Cas9 ka mete mitasyon byalelik an menm tan nan jiska 5 jèn (Nishizono et al., 2021). Pou rezon sa a, yo te transfèkte mRNA Cas9 ak senk gRNA espesifik pou jèn an menm tan nan selil ES yo. Sa a mete aksan sou pwomès ak efikasite pwosedi sa a, byenke mitasyon sa yo te ka pase lè liy fondatè yo te kwaze pou pwodui sourit senktup knockout. Etid la rapòte tou yon dekouvèt etonan: Selil ES yo pa nesesè ankò pou kreye sourit jenetikman modifye. Okontrè, pou retire pwodwi jèn espesifik, yo te enjekte Cas9 mRNA ak gRNA nan anbriyon nan etap yon sèl selil. Kòm rezilta, yo te kreye liy fondatè knockout ki teyorikman ka itilize pou etidye konsekans sipresyon jèn nan sourit (Qin et al., 2016). Kidonk, CRISPR/Cas9 pèmèt kreyasyon sourit transjenik pou trete TNBC a yon pri ki pi ba pase jeni jenetik tradisyonèl la. Lè l sèvi avèk sistèm CRISPR/Cas la, yo te devlope yon nouvo modèl sourit knockout ki ka avèk siksè entwodui mitasyon pwen nan youn oswa plis jèn andojèn nan TNBC. Baze sou konsèp sa a, modèl bèt TNBC yo kapab tou devlope lè yo itilize sipresyon BRCA1 ak p53 medyatè pa CRISPR/Cas9, sa ki lakòz pèt reparasyon HR, enstabilite jenomik, ak fenotip mutan (Annunziato et al., 2020).
Kounye a, yo itilize plizyè metòd tankou mamografi, imaj pa rezonans mayetik (IRM) ak ultrason pou dyagnostike kansè nan tete (TNBC). Sepandan, metòd sa yo gen kèk limitasyon. Yo itilize mamografi pou dyagnostike tisi tete lokal olye de metastaz, kote selil kansè yo te imigre nan lòt ògàn. Ultrason se pa yon metòd serye pou dyagnostike TNBC (Chen ak Lee-Felker, 2023). IRM gen pi gwo sansiblite pase ultrason ak mamografi, men presizyon dyagnostik li limite (Sha ak Chen, 2022). Byopsi tisi se yon fason pwogrese pou idantifye selil kansè yo. Sepandan, nan kèk ka, yon byopsi ka rate tisi kansè si zegwi a devye lwen zòn enterè a. Anplis de sa, li trè chè epi li ka twomatik pou pasyan an. TNBC se yon kalite kansè etewojèn, kidonk yon byopsi ka pa bay ase enfòmasyon sou kalite kansè a. Se poutèt sa, yon nouvo metòd dyagnostik serye pou detekte TNBC nesesè ijan. CRISPR/Cas9 ka sèvi kòm yon altènatif trè sansib ak minim pwogrese pou dyagnostik kansè nan tete. Pou rezon sa a, estrateji ki baze sou CRISPR/Cas9 yo ka itilize pou amelyore metòd PCR pou dyagnostik TNBC. Premyèman, pwoteyin Cas9 ak cpf1 nan sistèm CRISPR la yo itilize pou retire ADN ki pa espesifik, epi answit de pwoteyin sa yo (Cas9 ak cpf1) ka rekonèt sekans PAM lan anvan yo lye ak ADN sib la (Deepak Singh et al., 2021). Kidonk, PCR ka idantifye mitasyon ki asosye ak devlopman kansè. Plizyè etid te adopte estrateji sa a ki baze sou CRISPR pou detekte diferan mitasyon nan diferan kansè (Safari et al., 2019). Kidonk, metòd PCR ki baze sou CRISPR yo ka diminye depandans dyagnostik TNBC sou metòd pwogrese tankou imunoistochimi ki baze sou byopsi.
Chanjman jenotipik nan regilasyon reseptè òmòn yo te demontre tou nan TNBC (Chen ak Russo, 2009). Estrateji PCR ki baze sou CRISPR/Cas9 lè l sèvi avèk microarrays pou dyagnostik pwen-de-swen ka efektivman kontwole mitasyon sa yo (Hajian et al., 2019). Li ta ka bay founisè swen sante yo enfòmasyon ki enpòtan sou mitasyon espesifik nan pasyan TNBC yo, sa ki ta ka ede amelyore tretman yo. Sepandan, teknik konbine sa a gen limit. Se poutèt sa, anpil efò rechèch nesesè anvan metòd CRISPR/Cas-PCR sa a ka itilize nan swen sante pou dyagnostik TNBC (Yang et al., 2019).